维生素E(vitamin E,VE)又称生育酚,目前自然界有8种,包括、、与生育酚以及、、与生育三烯酚,其中生育酚的生物活性最大[1]。VE作为脂溶性抗氧化剂,不仅能清除自由基,还能阻断脂质
4006-054-001 立即咨询发布时间:2022-10-09 23:05 热度:
维生素E(vitamin E,VE)又称生育酚,目前自然界有8种,包括α、β、γ与δ生育酚以及α、β、γ与δ生育三烯酚,其中α生育酚的生物活性最大[1]。VE作为脂溶性抗氧化剂,不仅能清除自由基,还能阻断脂质过氧化,进而保护细胞和组织免受由自由基诱导的氧化损伤[2],维持生物膜的正常结构[3]。环类抗生素阿霉素(doxorubicin,DXR),是一种具有细胞毒性的化疗药物,广泛地用于各种肿瘤的治疗。DXR细胞毒性在杀伤肿瘤细胞的同时也导致了正常细胞组织的损伤,其肾毒性严格地限制了DXR的使用。故本实验以DXR对肾小球内皮细胞的DNA损伤作用为研究,探讨VE是否能抑制DXR的肾毒性。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 肾小球内皮细胞CRL?1927购于ATCC。最低必需培养基(Eagle’s minimum essential medium ,MEM )、L?2谷氨酰胺、小牛血清均为美国Gibco 公司产品。VE 、DXR、二甲基亚砜(DMSO)及4’,6?二脒基?2?苯基吲哚(DAPI)均购于Sigma公司。Olympus A×70 荧光显微镜购自日本Olympus 公司,DYY?6C 型电泳仪购自北京市六一仪器厂。
1. 2 细胞培养 培养液包含DMEM、10%小牛血清、0.03% L?2谷氨酰胺、100 U /ml 青霉素、125 mg/L 链霉素。培养箱设置为37 ℃、5% CO2环境。
1.3 药物处理及细胞分组 VE溶于99.5%乙醇,DXR溶于培养液。10 μmol/L DXR分别与0.1 mmol/L,1 mmol/L VE合用处理细胞2 h,8 h和12 h。细胞分为空白组(未经药物处理),溶剂对照组(99.5%乙醇处理),阳性对照组(10 μmol/L DXR处理),10 μmol/L DXR+0.1 mmol/L VE组,10 μmol/L DXR+1 mmol/L VE组。
1. 4 碱性彗星实验 药物处理细胞后,离心收集,调节细胞浓度至6×1010/L 。制备“三明治”凝胶:首先用100 μl 0.65%正常熔点琼脂糖,平铺在毛面载玻片上,并盖上盖玻片,置于冰上8 min,使琼脂糖凝固;移去盖玻片,再在第一层凝胶上铺单细胞悬液(15 μl 6×1010/L 细胞与75 μl 0.65%低熔点琼脂糖混合) ;最后在第二层凝胶上铺75 μl 0.65%低熔点琼脂糖, 第二、三制胶方法同第一层。最后,移去盖玻片,凝胶浸泡在4 ℃碱性裂解液(2.5 mol/L NaCl,100 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris base,1% sodium lauryl sarcosinate,1% Triton X?100 和10% DMSO 用前加入,pH=10 ) 中2 h。裂解完毕转移至盛有高pH电泳缓冲液( 300 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA ) 中以25 V,300 mA 电泳20 min。DAPI 染色,荧光显微镜观察结果。
1. 5 统计学处理 彗星实验结果应用comet score 软件分析尾相( TM )。实验数据以 x±s表示, 采用SPSS 12.0 软件进行单因素方差分析和Dunnett 检验, 显著性界值采用P< 0.05。
2 结果
10 μmol/L DXR处理CRL?1 927细胞2、8、12 h,彗尾长度与对照组相比明显增长。特别是处理细胞12 h后,彗尾长度由(4.61±0.67)μm增为(17.56±1.98)μm(见表1)。DXR与0.1 mmol/L VE共同处理细胞12 h后,彗尾的长度与DXR组相比明显变短,但明显长于对照组;处理2、8 h时两组彗尾长度无明显差异。DXR与1 mmol/L VE共同处理细胞2 h后,彗尾长度与DXR处理组无明显差异;处理细胞8、12 h后,DXR与1 mmol/LVE共同处理组彗尾的长度与DXR组相比明显变短,但仍长于对照组,12 h时彗尾的长度变化尤为明显(见图1)。
3 讨论
化疗药物DXR杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤了正常细胞,常可在治疗肿瘤的过程中造成组织损伤,因此其副作用限制了它在临床中的使用。因此如何提高用药安全性或者降低药物细胞毒性已经成为了医学界能否更好使用DXR的一大挑战。DXR与抗氧化剂的合用为减轻DXR毒性的有效方法之一。但迄今为止,对DXR心毒性的防治研究较多,对其肾毒性的防治研究少且不明确。碱性彗星实验(alkali comet assay),又称单细胞凝胶电泳SCGE(single cell gel electrophoresis),能够检测单SSB(single strand breaks)、双链的断裂和碱性不稳定点ALS(alkali labile sites)[4],是目前在单细胞水平上检测DNA 微损伤的最有效方法之一。本研究主要是观察DXR对肾小球内皮细胞的损伤以及抗氧化药物VE与DXR合用时是否可保护细胞免受其损伤。
本研究首次发现了DXR可导致肾小球内皮细胞DNA的损伤。10 μmol/L处理CRL1927细胞后,彗尾长度与对照组相比明显增长。DXR处理细胞2 h后,彗尾长度为(10.79±1.65)μm,8 h为(14.31±2.10 )μm ,12 h为(17.56±1.98) μm。因此证明了DXR对细胞的损伤具有一定的时间效应,可随时间的延长其毒性明显增加。其原因可能是DXR,蒽环类细胞周期非特异性药物,促进了自由基的产生,自由基又使DNA 的碱基和脱氧核糖发生化学变化, 引起碱基改变、破坏或脱落,以及DNA单链断裂(single strand breaks,SSBs )和双链断裂(double strand breaks,DSBs),DNA 与附近蛋白质可能形成DNA蛋白质交联等。 本文由教育大论文下载中心WwW.JiaoYuDa.CoM整理
早期研究报道VE既可优化DXR对肿瘤的治疗又不干扰其疗效[5~7],同时其他研究人员也发现VE可加强DXR的毒性[6]或者对DXR的疗效无任何作用[8,9]。
本研究还发现用DXR和VE共同处理细胞后,其毒性作用可被消弱。DXR+0.1 mmol VE组在处理细胞12 h后彗尾长度可减小到(11.01±1.52) μm,但是在2 h及8 h与DXR组相比无明显变化。但是较高浓度1 mmol VE和DXR共同处理细胞时在三个时间段,彗尾长度与DXR相比都明显变短。这说明了VE抑制DXR的作用有一定的时间剂量效应,其原因可能是VE是较强的抗氧化剂,具有清除自由基的作用。
综上所述,DXR造成了肾小球内皮细胞的DNA的损伤,而VE能抑制DXR对细胞DNA的损伤作用,因此可对抗DXR的肾毒性。
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