医生评职称论文发表 转化生长因子β1

发布时间：2022-10-09 23:04 热度：

　　【摘要】 目的：观察转化生长因子(TGF)β1在肠易激综合征(IBS)大鼠模型肠粘膜组织中的表达，初步探讨TGFβ1在IBS发病机制中的作用。方法：采用乙酸灌肠加束缚应激和单纯束缚应激方法制造IBS动物模型(IBS1、IBS2组 )，同时设立灌肠对照和正常对照组，行内脏敏感性评价后，用免疫组化的方法检测TGFβ1在IBS大鼠模型组和对照组肠粘膜组织中的表达情况。结果：IBS1、IBS2两模型组大鼠腹外斜肌收缩次数在不同扩张容量下均较正常对照组明显增加(P<0.05～0.01)，组织学分析显示各组大鼠均无明显的炎症性表现。TGFβ1在各组肠粘膜组织均有表达，各组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：TGFβ1作为一个抗炎性细胞因子在IBS发病机制中可能通过非直接的方式发挥作用。

　　【关键词】 转化生长因子β1;肠易激综合征;免疫组化 医生评职称论文发表

　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一种病因和发病机制尚不明确的功能性肠道疾病，临床以腹痛、腹胀伴排便习惯和大便性状改变(腹泻、便秘或腹泻便秘交替)为特征，其发病是在多种因素的综合作用下，最终导致内脏动力和内脏感觉异常。近年来研究发现，部分IBS患者存在炎症或免疫功能的异常改变，但其确切的发病机制尚不清楚 [1,2]。转化生长因子(TGF)β1能调节多种免疫细胞和非免疫细胞的生长﹑分化和功能，研究显示其对肠粘膜炎症有明显的负调控作用[3,4]。本实验研究了TGFβ1在IBS大鼠模型肠粘膜组织中的表达情况，初步探讨其在IBS发病机制中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物及分组 体重为(200±5)g 的成年雄性Wistar大鼠40只，购自湖南疾病预防控制中心，实验动物生产许可证号：SYXK(湘)20030002。整个实验操作过程均饲养于标准的Ⅱ级动物房，适应性饲养1周后随机分为IBS1组(乙酸灌肠+束缚应激组)、IBS2组(束缚应激组)、灌肠对照组(生理盐水灌肠+束缚应激组)、正常对照组共4组，每组10只。

　　1.1.2 主要试剂及仪器 兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体、PV6001两步法检测试剂盒和DAB显色试剂盒均由北京中衫公司提供，RM6280C型多道生理信号采集处理系统和针型插入型电极均由成都仪器厂提供，8F导尿管(直径2 mm，球囊最大容量3 mL，最大直径2 cm)用作结直肠内球囊扩张导管(浙江康康医疗器械有限公司生产)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 大鼠模型制备 IBS1组：实验前24 h禁食不禁水，乙醚麻醉后经肛门插入连接注射器的硅胶管(距肛门8 cm)，结肠内灌入40 mL/L的乙酸1 mL，缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾部抬高30 s，后用0.01 mol/L 的PBS 1mL冲洗结肠，放回笼中自由活动进食水，于第7天行束缚应激，将大鼠置于一限制起肢体活动但不影响其呼吸的特制透明圆柱形筒内，3 h后将大鼠放入饲养笼中[5];灌肠对照组：用生理盐水1mL代替乙酸灌肠，其余方法相同;IBS2组：按照Williams方法[6]略作修改，束缚前禁食24 h不禁水，乙醚麻醉后，用宽胶带束缚前肩、前上肢及胸部，限制前上肢搔抓头面部，但不限制其活动，束缚时间为1 h(自大鼠清醒后开始计时);正常对照组：不做任何处理。

　　1.2.2 腹壁肌电活动 记录腹壁肌电活动评估肠道敏感性[7]：大鼠实验前24 h禁食不禁水，3%戊巴比妥钠腹腔注射(1 mL/kg)麻醉下，将涂石蜡油的带气囊的8F导尿管插入结肠内(使气囊末端插入肛门内7.0 cm,在肛门外1.0 cm处将其固定在大鼠尾根部)后，大鼠固定在手术台上，将银丝双极电极插入腹股沟韧带上方、距中线1.5 cm一侧腹外斜肌上，待大鼠适应30 min后，每只大鼠给予球囊扩张3次，容量分别为1.0、1.5、2.0 mL，每次扩张持续5min，间隔30 s(以防肠道缺血)，记录5 min内腹外斜肌的收缩次数。肌电活动增高超过基线水平100 μV以上为一次有意义的腹部收缩活动。

　　1.2.3 组织形态学检查 肌电活动测定结束后，给予过量的麻醉药将大鼠处死，分别取横结肠、降结肠及直肠组织各一块，10%的中性福尔马林固定，显微镜下观察肠粘膜病理组织学改变。

　　1.2.4 TGFβ1免疫组化检测 常规脱腊至水化，3% 的H2O210 min，蒸馏水洗3次各3 min，微波加热抗原修复10 min，一抗(1∶100)，4 ℃过夜，室温下复温30 min，加兔抗大鼠IgG抗体HRP多聚体，37 ℃ 30 min(以上每步后用 PBS洗3次，每次3 min)，DAB显色(镜下控制显色时间)，后经苏木素复染，脱水透明、封片显微镜下观察结果。PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.2.5 结果判断 参照文献[8]的标准并略作修改：(1) 显微镜下观察着色广度：0分：阳性细胞数比率<1%，1分：阳性细胞数比率2%～25%，2分：阳性细胞数比率26%～50%，3分：阳性细胞数比率51%～75%，4分：阳性细胞数比率>75%。(2)着色强度：0分：细胞无着色，1分：阳性细胞染色呈淡黄色颗粒，2分：阳性细胞染色呈棕黄色颗粒，3分：阳性细胞染色呈深褐色颗粒。(3)广度×强度=总分(0～12):阴性(Ⅰ：0～1);阳性(Ⅱ：2～4);强阳性(Ⅲ：5～8; Ⅳ：9～12)。TGFβ1以细胞浆着色为阳性。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析进行比较;计数资料的比较采用χ2检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠腹壁肌电活动的比较

　　不同扩张容量模型组大鼠的腹外斜肌收缩次数较灌肠对照组和正常对照组明显增加(P<0.05～0.01)，提示存在内脏感觉过敏，而两模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

　　2.2 各组大鼠肠黏膜HE染色结果

　　各组大鼠肠黏膜组织结构完整，正常对照大鼠组和模型组大鼠肠黏膜HE染色均未见异常，未见黏膜的器质性损害及炎症细胞浸润，见图1ac。

　　2.3 各组大鼠肠黏膜组织中TGFβ1表达的比较

　　TGFβ1在IBS模型组及正常组肠粘膜组织中均有表达，主要见于肠粘膜上皮细胞和固有层炎性细胞(图2ac)，棕黄色颗粒主要见于细胞浆及细胞膜。正常对照组横结肠、降结肠、直肠组织TGFβ1表达阳性率分别为20%(2/10)、30%(3/10)、20%(2/10)，灌肠对照组表达阳性率分别为20%(2/10)、20%(2/10)、10%(1/10)，IBS1组表达阳性率分别为30%(3/10)、20%(2/10)、 20%(2/10)，IBS2组表达阳性率分别为20%(2/10)、30%(3/10)、10%(1/10)，经行×列表资料的Fisher确切概率法进行比较，IBS1、IBS2模型组TGFβ1表达的阳性率与正常对照组、灌肠对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。a：横结肠，b：降结肠，c：直肠

　　图1 大鼠肠粘膜组织HE染色(×100)安钰等.转化生长因子β1在肠易激综合征大鼠模型中表达的研究 a：横结肠，b：降结肠，c：直肠

　　图2大鼠肠粘膜组织TGFβ1的表达(×100)表1 各组大鼠在不同扩张容量下腹壁肌电活动的比较(注：与灌肠对照组和正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

　　3 讨论

　　IBS是一种涉及多种因素的复杂的功能性肠病之一，其发病机制尚不清楚，普遍认为是包括胃肠运动异常、内脏感觉敏感性增高、肠道的轻度炎症等在内的多种因素共同作用的结果，其中肠道的轻度炎症[1,9]是近年来关注的热点。早在20世纪60年代，Hiatt等在经手术获取的IBS患者结肠标本中发现肥大细胞增多这一现象，这是关于IBS患者肠黏膜存在炎症的最早证据，而Chadwick 等[1]首先提出了无急性胃肠炎史的IBS患者肠黏膜存在炎症，组织学检查发现上皮内淋巴细胞、固有层CD3细胞、CD25细胞及单核巨噬细胞增多。李延青等[10]对IBS患者肠黏膜Th1型细胞因子(γ干扰素受体和白细胞介素12)和Th2型细胞因子(白细胞介素4、10)表达情况研究发现，腹泻型 IBS患者肠黏膜γ干扰素受体和白细胞介素12表达显著增加，白细胞介素10表达呈下降趋势，而便秘型IBS患者细胞因子表达与对照组无差异，这说明腹泻型IBS患者内存在Th1/ Th2漂移，Th1反应增强。Gonsalkorale等[11]研究发现，IBS患者白细胞介素10的表达较对照组显著降低，而TGFβ1与对照组无显著性差异。这些均提示黏膜免疫在IBS的发病中起重要作用。本实验采用了乙酸灌肠加束缚应激和单纯束缚应激的方法制造了IBS大鼠模型[5,6]，实验发现乙酸灌肠7d后肠粘膜组织学检查正常，但大鼠对结直肠刺激的敏感性增高，而灌肠对照组大鼠对结直肠球囊扩张刺激的敏感性与正常对照组无明显差异，故排除了损伤因素所导致的内脏敏感性增高，与徐俊荣等[12]研究结果相同。常规组织学检查与单纯束缚应激组大鼠的肠粘膜组织学改变无差异，均未发现水肿﹑充血及炎症细胞浸润等病理学改变，反映了心理应激在IBS发病中的作用。

　　TGFβ是一个多功能的生长因子超家族，其主要作用包括调节细胞增殖和分化﹑参与胚胎发育的调节﹑抑制免疫反应等，TGFβ至少有5种异构体(TGFβ15)，其中TGFβ1最为常见，几乎参与了所有病理和生理过程，并与多种临床疾病密切相关[13，14]。王玉芳等[15]认为 TGFβ1不能对抗促炎性细胞因子，从而控制炎症，提示溃疡性结肠炎中可能存在TGFβ1信号通路缺损。Monteleone等[16]首次揭示了 TGFβ1信号放大级联缺损与炎症性肠病发病的关系，由此可见，TGFβ1是肠粘膜免疫的实质，在肠道炎症中发挥重要作用。TGFβ1本身是一种抗炎性细胞因子，在机体免疫调节中起重要作用，不仅抑制树突状细胞的成熟，而且TGFβ抑制辅助性TH1型反应，增强辅助性TH2型反应，增加调节性T细胞的比例[17,18]。近年来国外有学者研究显示，在感染后(即炎症后)IBS中发现肌层TGFβ1持续增高，可持续至感染后1个月甚至更长，他们认为增高的TGFβ1可通过增加环氧酶2和前列腺素E2的表达来提高平滑肌的兴奋性[19]。本实验研究了IBS大鼠模型中大鼠结、直肠组织病理学变化，结果显示无炎性细胞浸润等炎症性改变;实验还从蛋白质水平研究了TGFβ1在IBS大鼠模型肠粘膜组织的表达情况，结果显示各组之间TGFβ1表达的阳性率差异无统计学意义，这与Gonsalkorale等[11]研究结果相似，但不能就此排除其在IBS发病中的作用。已有研究证实TGFβ1作为一个抗炎性细胞因子对肠粘膜炎症有明显的负调控作用[3,4]，且国外有研究发现IBS患者肌层TGFβ1增高可通过增加环氧酶2和前列腺素E2的表达来提高平滑肌的兴奋性，提示可能与肠道的防御功能有关[19]，因此有关TGFβ1在 IBS发病中的作用仍有待进一步研究。